質量認證聚合氯化鋁PAC生產廠家基于實際污水A2/O工藝中懸浮污泥生物量減量實現缺氧生物膜中厭氧氨氧化菌的高度富集

　　質量認證聚合氯化鋁PAC廠家基于實際污水A2/O工藝中懸浮污泥生物量減量實現缺氧生物膜中厭氧氨氧化菌的高度富集。本研究基于缺氧生物膜和懸浮污泥對NO2-的競爭差異，提出了一種主流系統中穩定富集厭氧氨氧化菌的新策略。研究將實際市政污水在改進的厭氧-缺氧-好氧(A2/O)工藝下運行了500天。微生物分析表明，與懸浮污泥相比，缺氧載體生物膜具有顯著更高的厭氧氨氧化菌豐度(qPCR：0.74%-4.34%)(P<0.001)。批量實驗表明，缺氧載體生物膜中的厭氧氨氧化菌有助于高效脫氮的同時伴有部分反硝化作用(NO3-→NO2-)。厭氧氨氧化菌屬Ca. Brocadia在生物系統懸浮污泥意外損失時高度富集。進一步的批量實驗發現，懸浮生物量的減少有助于厭氧載體生物膜中厭氧氨氧化菌的富集，由于懸浮污泥與厭氧氨氧化菌具有強烈的NO2-競爭(NO2-→N2)(通過上調nirK)。宏基因組測序結果顯示Ca. Brocadia在缺氧載體生物膜中占主導地位，并且是NO3-→NO2-過程narG的最重要貢獻者，這可能促進了與異養細菌的NO2-競爭。該A2/O工藝的低出水總氮(8.9 mg ± 1.0 mg N/L)歸因于部分反硝化與厭氧氨氧化的耦合，表明該工藝適用于一般的進水N濃度范圍(30 mg-50 mg NH4+-N/L)的市政污水處理廠(WWTP)。基于厭氧氨氧化對NO2-的特殊競爭偏好，該研究為在市政WWTPs中富集厭氧氨氧化細菌提供了一種有前景且實用的選擇方案。

　　實驗設計

　　結果與討論

　　1 脫氮性能A2/O生物反應器運行了500天用于實際市政污水處理(圖1)。在第I階段(第280天至第325天)，反應器以厭氧/缺氧/好氧模式運行。接種載體后，出水NO3--N在1個月內逐漸下降，平均濃度保持在14.1 mg ± 4.0 mg N/L(圖1b)。在Ⅱ階段(第326至442天)，由于第326天的操作失誤，大量懸浮污泥意外流失(2873 mg VSS/L至534 mg VSS/L，圖S2)。污泥流失嚴重影響了A2/O系統的硝化能力，出水NH4+-N迅速惡化，從1.3 mg N/L變為到31.8 mg N/L(圖1a)。在接下來的53天中，硝化性能逐漸恢復，出水TIN濃度在第379天到第442天期間為13.7 mg ± 2.8 mg N/L。為了研究進水負荷對穩定厭氧氨氧化的影響，在第III階段(第443天至第500天)，進水NH4+-N從46.1 mg ± 3.7 mg N/L減少到 29.0 mg ± 2.4 mg N/L(圖 1a)。調整后，出水TIN濃度迅速下降并保持相對穩定：在接下來的八周內，平均出水NO3--N為7.6 mg ± 1.0 mg N/L(TIN：8.9 mg ±1.0 mg N/L)。整個實驗過程使用實際市政污水連續進料，在正常運行條件下，反應器脫氮性能相對穩定。先前的研究表明，當進水NH4+-N約為50 mg N/L時，部分氮損失可歸因于厭氧氨氧化，使得脫氮性能高于傳統的A2/O工藝。與之前的研究結果不同，本研究中的進水NH4+-N從46.1 mg ± 3.7 mg N/L下降到29.0 mg ± 2.4 mg N/L，但脫氮性能保持穩定且令人滿意，表明該工藝適用于市政污水處理廠的一般進水氮濃度范圍(30 mg-50 mg NH4+-N/L)。

　　圖1 營養元素去除性能的變化：(a)進水氨氮、出水氨氮以及氨氮去除效率;(b)出水中的硝酸鹽、亞硝酸鹽和TIN;(c)進水COD/TIN比和TIN去除效率。

　　2 厭氧氨氧化活性及其對脫氮的貢獻為了確定缺氧載體生物膜內的氮轉化過程，進行批量實驗以模擬具有NH4+-N、NO3--N和乙酸鈉的缺氧區(圖2a，圖S3)。如第448天所示，NO3--N和COD迅速下降，NO2--N顯著積累，峰值為13.4 mg N/L。隨后，NO2--N和NH4+-N分別以2.6 mg N/L/h和1.4 mg N/L/h的去除速率逐漸減少。當有機物幾乎完全消耗時，NO2--N和NH4+-N繼續減少，去除速率分別為0.4 mg N/L/h和0.4 mg N/L/h。在此期間，脫除的NO2--N與NH4+-N之比為1.09，產生NO3--N與脫除NH4+-N之比為0.12，與文獻報道的1.14和0.16接近。在這個實驗過程中，N2O的比例非常低，可以忽略不計(圖S4)。這些結果表明缺氧載體生物膜對硝酸鹽-亞硝酸鹽的轉化比厭氧氨氧化比活性重要，缺氧生物膜具有比NO2-還原速率更高的NO3-還原速率。在實驗的初始階段，NO2--N迅速產生，然后積累而不是立即轉化為氮氣。NO2--N與NH4+-N之比可以反映厭氧氨氧化活性與反應時間之間的非線性變化，表明有機物的存在影響NO2-競爭。批量實驗歷時10多個小時，但A2/O系統中缺氧區的HRT要短得多(2.86 h)，表明在較低有機物濃度下，適當延長HRT可能會提高厭氧氨氧化的脫氮性能。在不同階段觀察到厭氧氨氧化比活性和對氮損失的貢獻隨著運行狀態(懸浮污泥生物量和進水NH4+-N)波動(圖2a)。尤其地，批量實驗表明，第280天厭氧氨氧化活性為0.17 kg N/m3/d，對脫氮的貢獻率為68%。在第430天，缺氧載體生物膜的厭氧氨氧化活性增加到0.17 kg N/m3/d，其對脫氮的貢獻為70.6%。除了懸浮污泥的濃度外，其他操作參數無變化，因此缺氧生物膜中厭氧氨氧化活性的增加可能與懸浮污泥的生物量損失有關。當III期進水NH4+-N減少時，厭氧氨氧化活性增加到0.21 kg N/m3/d(圖2a)，第462天時去除73.4%的氮。這可能是由傳質效率提高、外部生物膜脫落引起。缺氧載體生物膜中的厭氧氨氧化細菌對部分脫氮有積極貢獻，如下詳述。首先，在不同批量實驗的缺氧載體生物膜實驗中，厭氧氨氧化貢獻了68%-73.4%的氮去除(圖2a)。其次，在A2/O系統中，基于質量平衡(表S1)，厭氧氨氧化對氮損失的貢獻約為29.2% ± 6.7%。在COD/N < 3.0下，該生物系統中的氮去除率(NRR)范圍為0.04 kg N/m3/d至0.08 kgN/m3/d，與報道的傳統硝化/反硝化工藝性能相當，甚至與污水厭氧氨氧化系統相當(表S2)。第三，經過400天的運行，厭氧氨氧化細菌在缺氧載體生物膜中仍然活躍，這強烈表明在脫氮中不能忽略厭氧氨氧化。此外，氮去除率的提高普遍地歸因于厭氧氨氧化生物量的增加。在這項研究中，厭氧氨氧化細菌豐度(圖2b)顯著高于在先前報道A2/O類似工藝中的水平，這可能有助于提高自養脫氮性能。

　　圖2 (a)不同階段厭氧氨氧化活性、貢獻和生物膜厚度;(b)和(c)分別表示缺氧載體生物膜和懸浮污泥中的厭氧氨氧化菌的基因拷貝數和相對豐度。 3 缺氧載體生物膜中高度富集的厭氧氨氧化菌根據qPCR結果，缺氧載體生物膜中厭氧氨氧化菌的豐度(0.74%-4.34%)(圖2b)顯著高于懸浮污泥(0.03%-0.08%)(P <0.001)(圖2c)。在第I階段(第280天)，缺氧載體生物膜和懸浮污泥中的厭氧氨氧菌豐度分別為2.29 × 109 copies/g干污泥(0.74%)和2.26 × 107 copies/g干污泥(0.04%)。當第II階段懸浮污泥流失時，第430天時缺氧生物膜中厭氧氨氧化細菌豐度增加到最大值1.47 × 1010 copies/g干污泥(4.34%)。減少進水NH4+-N，在第462天，缺氧載體生物膜中的厭氧氨氧化細菌豐度仍然保持在8.35 × 109 copies/g干污泥(2.87%)，這與之前的研究一致，并且表明厭氧氨氧化細菌對缺氧載體生物膜具有顯著的生態位偏好。這些結果很重要，因為它們證實了厭氧氨氧化細菌可以在高豐度的低氨廢水中長期存活。厭氧氨氧化細菌的原位富集以及進一步的長期維護是污水厭氧氨氧化工藝的主要瓶頸之一。以往的研究表明，厭氧氨氧化細菌在傳統的全規模市政污水處理廠中普遍存在。根據qPCR結果，本研究中厭氧氨氧化菌的豐度(0.74%-4.34%)與之前接種成熟厭氧氨氧化污泥的系統相當。缺氧載體生物膜中厭氧氨氧化細菌的高豐度解釋了正向的自養脫氮。因此，結合前人的研究，本研究的結果表明A2/O系統可以在主流生物系統中持續保持較高水平的厭氧氨氧化細菌豐度。 4 主流生物系統厭氧氨氧化菌高度富集的關鍵隨著懸浮污泥的損失(圖1)，缺氧載體生物膜中厭氧氨氧化細菌的豐度增加到極高的水平(圖2b)。針對厭氧氨氧化的特殊高濃縮工藝，進行了模擬缺氧區(NH4+、NO3--N和醋酸鈉)的批量實驗，設計了三種模式：缺氧載體生物膜、懸浮污泥以及兩者的結合。在缺氧載體生物膜中，NO3--N和COD的濃度迅速下降，NO2--N顯著積累，峰值為15.5 mg N/L(圖3a)。NO2--N和NH4+-N隨后逐漸減少，去除率分別為2.03 mg N/L/h和0.89 mg N/L/h。相比之下，在懸浮污泥中，由NO3--N還原的NO2--N積累非常少(圖3b)，NH4+-N的下降趨勢明顯更慢。懸浮污泥和缺氧生物膜共存的結果表明，NO3--N在0.5小時后沒有減少，在此期間只有少量NO2--N積累。懸浮污泥的加入增強了亞硝酸鹽還原過程(NO2-→N2)(圖3c)。這些結果表明缺氧生物膜與懸浮污泥的NH4+-N消耗率存在顯著差異。批量實驗證實懸浮污泥的存在是反硝化與厭氧氨氧化耦合的關鍵因素，控制懸浮生物量可縮短主流厭氧氨氧化原位富集的調試周期。即，懸浮污泥加強了亞硝酸鹽還原(NO2-→N2)作用，削弱了厭氧氨氧化的競爭力。為了進一步了解缺氧載體生物膜和懸浮污泥之間的生態位差異，分析了微生物群落結構。16S rRNA測序所得的厭氧氨氧化細菌豐度的動態變化(圖4)與qPCR結果一致(圖2)。總的來說，結果(圖4)表明Ca. Brocadia是缺氧載體生物膜中已知的主要氮轉化功能微生物，而Nitrospira、Dechloromonas和Nitrosomonas在懸浮污泥中占主導地位。除了Ca. Brocadia在缺氧生物膜中富集外，Dechloromonas、Azospira和Thauera的比例在懸浮污泥中沒有完全恢復(第430天)，這與污泥損失前有顯著差異(第280天，P <0.01)。這些結果表明懸浮污泥中含有較多的反硝化細菌，較少的厭氧氨氧化菌，而缺氧載體生物膜中的微生物群落結構則相反。出乎意料的厭氧氨氧化菌富集可能是因為懸浮污泥中存活的反硝化細菌比缺氧載體生物膜多。生物反應器中懸浮污泥的損失導致反硝化細菌的急劇減少，NO2-的異養還原減弱。這增強了厭氧氨氧化細菌競爭NO2-的能力和在短時間內進一步增殖的機會。當懸浮污泥增加到以前的水平時，隨著進水NH4+-N的減少，缺氧載體生物膜中的厭氧氨氧化菌豐度下降。此外，批量實驗和微生物分析再次證實，缺氧載體生物膜對于硝酸鹽到亞硝酸鹽的轉化和厭氧氨氧化活性的維持至關重要。

　　圖3 缺氧載體生物膜和/或懸浮污泥批量實驗中氮與COD的變化。

　　圖4 缺氧載體生物膜和懸浮污泥中的微生物群落分析(屬水平)。 5 缺氧生物膜中富集的Ca. Brocadia的基因檔案在缺氧載體生物膜中，Ca. Brocadia的豐度在第430天達到最高水平(圖2、圖4)。宏基因組測序結果(圖S5)進一步揭示了物種Ca. Brocadia fulgida(4.14%)和Ca. Brocadia sinica(2.17%)在缺氧載體生物膜中的豐度顯著高于懸浮污泥(分別為0.22%和0.13%)(P <0.001)。本研究中Ca. Brocadia的主導地位與在污水厭氧氨氧化系統中觀察到的典型屬一致，特別是處理實際城市污水時。研究報告稱，Ca. Brocadia在市政污水處理廠的不同處理單元中始終占據主導地位，而Ca. Jettenia或Ca. Kuenenia通常在處理高強度廢水中占主導地位。然而，本研究中Ca. Brocadia的高度富集只是表面現象，需要進一步獲取信息研究富集的厭氧氨氧化優勢種為Ca. Brocadia而不是其他屬的原因。為闡明Ca. Brocadia的富集機制，分析了優勢菌中涉及硝化、反硝化和厭氧氨氧化的關鍵酶(圖5，圖S6)。對于硝化作用，負責的amoA(470 hits)與Nitrosomonas(438 hits)密切相關，并且僅在懸浮污泥中被觀察到(在缺氧載體生物膜中沒有)，這與微生物群落差異相符(圖S5)。考慮到反硝化和厭氧氨氧化的協同過程(圖3，圖S3)，進一步研究了功能細菌的關鍵酶。反硝化涉及多種氮形式(NO3-、NO2-、NO、N2O和N2)，因此，整個代謝過程需要對酶進行選擇。例如，參與硝酸鹽到亞硝酸鹽過程的narG與多種細菌有關。具體來說，narG在缺氧載體生物膜中主要由Ca. Brocadia(3618 hits)貢獻，而在懸浮污泥中，它主要由Nitrospira(6314 hits)貢獻，并且與Dechloromonas的關系最密切(1724 hits)，其次是Sulfuritalea(566 hits)。對于nirS，樣品的總豐度幾乎沒有差異，但其分布主要與懸浮污泥中的Dechloromonas(1472 hits)和缺氧載體生物膜中的Chloroflexi(878 hits)有關。有趣的是，這些結果表明懸浮污泥中nirK的相對豐度比缺氧載體生物膜高2.6倍(表S3)，并且主要由懸浮污泥的Nitrospira(1976 hits)貢獻。最近的研究表明，Nitrospira具有顯著的NO2-氧化潛力，懸浮污泥中nirK的上調可能會增加與缺氧載體生物膜競爭NO2-的能力。對于厭氧氨氧化菌，獨特的編碼基因Hzs與缺氧載體生物膜中優勢屬Ca. Brocadia(5156 hits)密切相關，但在懸浮污泥中很少檢測到Hzs基因(170 hits)(圖5)。類似地，Hdh是厭氧氨氧化反應過程中催化中間體肼氧化成氮氣的關鍵酶，其在缺氧載體生物膜中(3264 hits)也明顯高于懸浮污泥中(106 hits)。缺氧載體生物膜中的厭氧氨氧化菌豐度越高，細菌Hzs和Hdh的豐度越高。這些結果與微生物群落分析一致，證實了厭氧氨氧化細菌的生態位偏好。基于編碼基因、功能微生物和特定代謝機制，可以了解部分反硝化過程中的NO2-循環。首先，從氮轉化基因的角度來看，缺氧載體生物膜中的narG/(nirK + nirS)比值(2.45)高于懸浮污泥(1.75)(表S3)，這有利于缺氧生物膜通過NO3-還原生成NO2-。至關重要的是，nirK在懸浮污泥中含量很高，但在缺氧載體生物膜中幾乎不存在。nirK由懸浮污泥的Nitrospira(1976 hits)貢獻(圖5)，而由于無氧條件，缺氧載體生物膜不利于其生長。其次，最豐富的厭氧氨氧化細菌屬Ca. Brocadia是缺氧載體生物膜中硝酸鹽轉化為亞硝酸鹽的關鍵narG貢獻者(圖5，圖S7)。因此，Ca. Brocadia可能會在損失懸浮污泥時促進NO2-的競爭，然后提高其在缺氧載體生物膜中的主導地位。第三，與一些Ca. Brocadia菌株相關聯的nrfA基因(876 hits)，可以將NO3-還原為NO2-或NH4+與乙酸鹽的氧化耦合。因此，厭氧氨氧化細菌將硝酸鹽異化還原為銨(DNRA)可能會導致一些氮損失。最后，之前的研究報告稱，由于Thauera對NO3-還原的貢獻大于NO2-還原，反硝化細菌Thauera在此的作用至關重要。Thauera在缺氧載體生物膜中的增殖速度遠高于懸浮污泥(分別為2.94%和1.06%)(圖4，圖S5)，并且在缺氧載體生物膜中比懸浮污泥中含有更多的narG(分別為430 hits與134 hits相比)(圖5)，表明NO2-供應對厭氧氨氧化的潛在作用。基于上述結果，缺氧載體生物膜的初步概況如圖6所示，通過形態學(圖S8)、化學(圖3a，圖S3)和微生物群落分析(圖4，圖5)，描述了Ca. Brocadia的富集機制。厭氧氨氧化代謝需要NO2-作為電子受體。在這項研究中，雖然NO2-沒有從外部供給到缺氧區，但它可以由缺氧載體生物膜中的NO3-還原產生，并且部分被厭氧氨氧化消耗(圖3)。在這些前提條件下，有兩個因素進一步加速了厭氧氨氧化的富集：富含nirK/S的懸浮污泥的損失增加了缺氧載體生物膜中Ca. Brocadia的NO2-競爭能力(圖5),而與Ca. Brocadia特殊代謝特征密切相關的narG加強了硝酸鹽到亞硝酸鹽的轉化，有助于厭氧氨氧化的快速富集(圖5，圖S6)。

　　圖5 缺氧區生物膜和懸浮污泥中檢測到的氮代謝關鍵酶的分類學起源。Hdh：肼脫氫酶;Hzs：肼合成酶;AmoA：細菌氨單加氧酶亞基A;NrfA：氨異化亞硝酸還原酶;NarG：細胞質硝酸還原酶α鏈;NapA：周質硝酸還原酶前體;NirS：細胞色素cd1亞硝酸還原酶;NirK：Cu-亞硝酸鹽還原酶;NorB：細胞色素或醌醇依賴型一氧化氮還原酶;NosZ：一氧化二氮還原酶。

　　圖6 A2/O系統中的缺氧載體生物膜進行的生化反應(AMX：厭氧氨氧化細菌，主要為Ca. Brocadia;DE：反硝化細菌)。 6 市政污水處理廠中的工程應用在工程應用方面，當前和以往對A2/O工藝的不同研究為污水處理廠中厭氧氨氧化細菌的原位富集提供了實驗基礎;包括長期性能、批量實驗、微生物群落和功能基因分析在內的實驗證據證實了理論基礎。由NO3-還原的NO2-可以被厭氧氨氧化菌部分消耗(圖3，圖S3)，特別是在缺氧條件下(例如厭氧或缺氧區)。這種耦合過程也與最近基于厭氧氨氧化的研究中觀察到的硝酸鹽到亞硝酸鹽的反應一致。此外，異養反硝化通常經歷NO(一氧化氮)的生產過程，從而為利用NH4+和NO的厭氧氨氧化創造了宏觀環境。由于自發富集的發生(非接種)，缺氧載體生物膜提高了主流厭氧氨氧化細菌的穩定耐受性。實驗室或中試規模的實驗通常是通過接種來自側流或其他生物反應器的成熟厭氧氨氧化污泥來實施的，但在全規模的污水處理廠中直接接種是不切實際的。盡管如此，這項工作為通過厭氧氨氧化的“原位”富集處理市政污水提供了堅實的證據，預計這將在未來的長期實驗室規模和中試規模實驗中得到進一步驗證。懸浮污泥的控制更簡單，不需要復雜的多因素控制和高科技的專業管理人員。此外，最近有報道稱comammox是傳統硝化/反硝化污水處理廠中的主要硝化者(NH4+直接轉化為NO3-)。它的存在對連續流動生物系統的好氧區中的穩定亞硝化構成威脅，但它可能有利于通過回流缺氧區進行部分反硝化。這里介紹的工作只是部分厭氧氨氧化方向的冰山一角，未來的研究和工程項目預計將在市政污水處理廠實施。優化缺氧載體生物膜與懸浮污泥之間的協同關系可能有利于提高脫氮性能。宏基因組分析的解釋表明這些微生物的潛力并非實際活性，因此進一步研究代謝物水平(RNA或蛋白質)是表征這些微生物(例如Ca. Brocadia、Nitrospira、Thauera)的活性功能所必需的。此外，當缺氧載體生物膜厚度減小時(圖2a)，懸浮污泥中的厭氧氨氧化細菌豐度增加(圖2c)，其對氮損失的定量影響需要進一步研究。從更廣泛的角度來看，厭氧氨氧化菌不僅參與氮轉化，也參與碳代謝，這意味著對復雜環境條件的調控是必要的(例如COD/N、DO、空間模式)。

　　結論

　　本研究調查了連續流部分反硝化/厭氧氨氧化系統中缺氧生物膜和懸浮污泥的生態位差異。在缺氧區引入生物膜可以在一般進水N濃度范圍內(30 mg-50 mg NH4+-N/L)保持相對高豐度的厭氧氨氧化細菌(0.74%-4.34%)。Ca. Brocadia在缺氧載體生物膜中占主導地位，而Nitrospira在懸浮污泥中占主導地位。厭氧氨氧化的意外富集是由于懸浮污泥的突然損失所致。懸浮污泥中維持NO2-快速還原的高nirK，以及與Ca. Brocadia相關的較高豐度narG，可能會進一步強化缺氧載體生物膜內硝酸鹽-亞硝酸鹽的轉化。微生物群落分析和批量實驗結果表明，控制懸浮生物量有助于厭氧氨氧化菌富集。基于市政污水處理的部分反硝化，此項工作為厭氧氨氧化菌的原位富集提供了全面理解。

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