高規格鐵碳微電解填料生產廠家厭氧氨氧化一個關于時間和耐心的故事- 從43年前談起

　　高規格鐵碳微電解填料廠家厭氧氨氧化一個關于時間和耐心的故事- 從43年前談起。在1986年之前，人們都不相信有可在厭氧環境下“氧化”氨氮的細菌。一個荷蘭生物工程師和一個微生物教授的偶遇改變了一切。到了1999年7月，這位微生物學家連同其他幾位學者，在《Nature》期刊上宣布了一個重大發現：“厭氧氨氧化”菌屬于浮霉菌門。在日后關于anammox的文章里，這個人的名字會被反復引用，他的名字叫Gijs Kuenen。

　　如果你不知道Gijs Kuenen是誰的話，那說明你對厭氧氨氧化的歷史還知之甚少。如果說誰最有資格為厭氧氨氧化作傳，那可能是非Gijs Kuenen教授莫屬。幸運的是，Kuenen教授最近還真的將過去40年厭氧氨氧化史好好地梳理了一遍，并發表在2020年第二期的《Environmental Microbiology》上，題為《Anammox and Beyond》。今天在本期微信推送里，我們為大家整理一下關于厭氧氨氧化的那些事。

　　從硫細菌說起1940年12月9日，Gijs Kuenen出生于荷蘭阿姆斯特丹西邊的小城Heemstede。1972年，Kuenen教授在格羅寧根大學獲得微生物學博士學位。畢業后他在美國洛杉磯和荷蘭格羅寧根輾轉了幾年，隨后在1980年來到代爾夫特，成為了荷蘭代爾夫特理工大學TU Delft的第四任微生物教授。前三人都是代爾夫特理工的傳奇人物，包括Martinus Beijerinck、Albert Kluyver和Cornelis van Niel。

　　Kuenen教授說，每次回想，都讓他愈發感覺微生物界各種人和事之間奇妙的聯系。他說關于anammox的故事可以從他在格羅寧根大學讀本科的時候說起。當時這門課的授課老師是Hans Veldkamp教授(1923-2002)，Veldkamp的導師則是Albert Kluyer (圈子的傳承)。

　　在為期六周的微生物課里，他學會了如何對多種微生物和代謝類型進行富集培養，而這種方法正是TU Delft首任微生物教授Martinus Beijerinck發明的。后來Veldkamp教授則成為了Kuenen教授博士學位的導師。他的博士論文是關于兩種硫氧化菌(SOB)的比較。在此后很長的一段時間里，他的研究都是圍繞SOB展開的。

　　在1980年他回到Delft之后，他開始尋求SOB在工業上的應用。巧合的是，當時荷蘭瓦赫寧根大學的Gatze Lettinga教授正在研究污水的厭氧處理技術。兩位教授聯合本地一家叫Paques的小公司，成功地開發了生物脫硫工藝，去除污水中的硫化氫，并回收單質硫。

　　Paques公司后來也將這項工藝技術商業化，取名THIOPAQ。取名者正是Kuenen和Lettinga聯合培養的博士生Cees Buisman，后來他也成為了瓦大環境系的教授。

　　在大學當教授之余，當時Kuenen每周會抽幾小時給一家叫Gist-Brocades (GB)的生物公司當咨詢顧問。1987年，GB公司請他為公司一套新的污水厭氧處理系統的硫循環做技術指導。這套系統本來是要用來解決工廠產生的臭氣問題的。

　　但在此期間，GB公司的運行人員卻發現系統中一個奇怪現象——中試運行數月后，反硝化反應池的氨氮濃度下降了，硝酸鹽也減少了，還有明顯的氮氣產出。“書里不是說氨氮只能在好氧條件才會轉化嗎?反硝化池的氨氮濃度應該保持不變才對啊?”時任GB公司研究員的Arnold Mulder對此十分不解。他通過領導找到了 Kuenen教授進行咨詢。

　　圖：1984年的Gist Brocades 青霉素制藥廠

　　Mulder先生的發現喚起了Kuenen教授塵封了10年的記憶，他告訴Mulder：“我10年前就看過一篇paper報道過這個現象。” Kuenen教授指的是1977年67歲的奧地利理論化學家Engelbert Broda寫的題為《Two kinds of lithotrophs missing in Nature》(德語原題《Zeitschrift für allgemeine Mikrobiologie》)的文章。此文在當時學術圈可謂一聲驚雷。當時37歲的Kuenen也拜讀了這篇文章，并和同事們展開討論，但他們大都認為氨是不可能在厭氧條件下被氧化的。

　　兩人開始了進一步的研究。很有商業意識的Arnold很快給這個潛在工藝起了一個朗朗上口的名字——ANAMMOX(厭氧氨氧化)。然而，他們初期的嘗試并不算成功：他無法通過傳統的培養富集法提取出這個反應發生的微生物，因此無法確定這是一個自發的化學反應，還是一個生物反應。

　　Kuenen此時又想起了奧地利人Broda的文章里列出的兩條熱力學方程式：

　　Kuenen教授提議用15-N同位素示蹤技術來確認氮氣是否來自氨氮，并將此重任交給了他的一位女碩士生——Astrid van de Graaf。Astrid在實驗室用流化床反應器做實驗，成功發現了14,15-N2。這個發現固然讓人激動萬分，但他們還需要更多的證據來充分印證這個反應的生物屬性。

　　幸運的是，Kuenen教授向荷蘭技術基金會(STW)申請到資金為Astrid專門開設一個博士項目，確保后者可以安心將研究進行下去。

　　在證明生物反應的存在后，Astrid接下來要繼續用15-N示蹤標記法識別各種中間物和最終產物，并嘗試富集反應的微生物。這項工作的挑戰巨大，別的不說，單考慮到Anammox菌超慢的生長速率(約0.001-0.002/h)，Astrid的工作量就可想而知。她的勇氣也值得欽佩。幸好皇天不負有心人，在一次偶然的嘗試中，他們發現anammox反應的基質是亞硝酸鹽，而不是硝酸鹽，而且部分亞硝酸鹽會轉化成硝態氮用于固定二氧化碳。

　　第一個20年

　　Kuenen教授在1980年入職TU Delft后的20年可以算是厭氧氨氧化的第一個20年。這個階段以驗證anammox為焦點，在熱力學方程式為指導，最終通過富集培養、流化床反應器、同位素示蹤標記等手段證明了anammox的存在，并描繪了基本的代謝路徑。

　　Astrid在完成她的博士學位后，并沒有選擇繼續anammox的研究，1994年，在Delft當了6年研究員之后，她選擇到荷蘭科學中心NEMO做科普內容方面的工作。Kuenen教授將下一個挑戰交給了Marc Strous博士，讓他對anammox菌進行富集提純。利用SBR反應器，Marc成功地可重復地培養高產量的anammox菌，純度提高至70%。

　　有了高純度的微生物，Kuenen教授的團隊可以做更多分析了。他找到澳洲昆士蘭大學的分子生物學教授John Fuerst幫忙確認目標微生物。借助電子顯微鏡的近距離觀察，他們發現這些細胞有一個奇怪的、靠膜隔開的內室。這可是一個大驚喜!要知道，只有更復雜(真核)細胞才有這種隔室，就像人類細胞擁有的細胞器(organelles)。

　　他們將這個東西取名厭氧氨氧化體(anammoxosome)。這些細胞器負責執行特定的生物學功能，對細胞組分、代謝過程和信號傳導途徑起時空控制作用。簡單的原核細胞和細菌都沒有細胞器。目前科學家只知道浮霉菌(Planctomycetes)具有這種結構，因此研究團隊推斷anammox菌屬于該門。

　　圖：anammox細胞的透射電子顯微鏡照片和截面手繪圖(比例尺0.2μm)

　　話說浮霉菌非常奇特，因為它同時含有細菌、真菌和古菌三大菌屬的特性，因此有些人認為該菌在早期可能跟三大菌屬是同一個祖先。只是DNA的研究將它們歸在了細菌屬一類。可以說，浮霉菌的出現模糊了細菌的定義。

　　在此之前，沒有人將浮霉菌門跟厭氧氨氧化拉上關系，但Kuenen教授的團隊用氨氮和亞硝態氮培養出了這種細胞，底物也隨反應過程消失。這也從側面說明anammox菌的特別之處。

　　這個說個題外話：他們將這個第一次測序分析的anammox菌取名Candidatus Brocadia anammoxidans：anammoxidans表示其獨特的生化特性，Brocadia既表示了這些細菌的發現地(Brocades)，另外也因為這些鮮紅色的細菌讓研究者聯想到明艷的織錦。

　　第二個20年

　　“21世紀是生物的世紀。”這句話雖然更多被拿來揶揄，但在我們看來，到本世紀再來看，它所表達的可能就變成真知了。就以anammox為例，在2000-2020年之間，關于它的許多新發現都有賴于生物技術的進步。

　　16S rRNA基因測序的普及幫助科學家對更多的anammox菌進行命名。例如Mike Jetten和Michael Wagner就說服法國基因測序中心Genoscope幫Kuenen團隊在一個流化床反應器的富集物進行DNA，并找出了新的菌種，并以Kuenen的姓命名(Candidatus Kuenenia stuttgartiensis)。測序結果也顯示基因組相當大(4.27 Mb)，還含有大量細胞色素基因，這也解釋了anammox菌呈紅色的原因。

　　這也開啟了anammox菌的宏基因組分析時代。隨著DNA測序技術的發展，Kuenenia菌的基因組通過Mike Jetten教授帶領的團隊得到進一步完善。Jetten團隊開展大量的生物化學和酶學研究，在anammox的代謝路徑方面取得了重大突破。例如通過結構分析發現anammoxosome是能量轉化的場所，又例如發現一氧化氮才是許多anammox菌的反應中間物(而不是羥胺)。

　　圖：Jetten團隊總結的anammoxosome的能量代謝流程圖

　　可以說，21世紀以來，厭氧氨氧化研究已經遍及各個方面，從基因組學、蛋白組學、環境和生態微生物學。值得一提的是，雖然實驗和分析手段在過去20多年有了很大改進，不過時至今日，科學家依然無法得到純種的anammox細菌，這也是為什么這些菌目前都以Candidatus命名。Kuenen表示希望他的學生以及學生的學生們可以早日得到單菌株，這樣就可以摘掉Candidatus的前綴。

　　沒有終點的探索

　　之前我們提到Mulder先生早在上世紀80年代末就為Anammox工藝注冊了專利。但因為anammox菌超慢的生長速率，那個年代的人對anammox技術的前景并不看好，壓根沒有公司感興趣!唯獨Mark van Loosdrecht教授叫他的學生Udo van Dongen試著去搭一個兩段式的反應系統，第一段將部分氨氮氧化成亞硝態氮，第二段是厭氧氨氧化流化床。實驗結果成功打動了鹿特丹的Dokhaven污水廠。后者和TU Delft合作進行中試實驗，處理厭氧消化池的高濃度氨氮出水。最后的結果如今大家都以知道——側流厭氧氨氧化工藝已經成為很成熟的工藝。但可能不為人所知的是，Kuenen教授和Van Loosdrecht教授當時可是通過2年多的穩定運行才最終打動鹿特丹市所屬的水委會，為這個工藝爭取到了工程驗證的機會。

　　Kuenen教授在這篇12頁的綜述里，將學術界和工程界在1977到2020年里對厭氧氨氧化認知的變化都寫了一遍。這是一個關于時間和耐心的故事。43年，說長不長，說短不短。但對于1972年博士畢業、2005年退休的Gijs Kuenen教授來說，厭氧氨氧化幾乎貫穿了他的科研生涯。雖然硫氧化菌才是Kuenen教授的摯愛，但最后讓他流芳百世的卻是厭氧氨氧化菌(anammox第二個屬Kuenenia就以他命名)。

　　Kuenen教授在文章最后說道：“對作者而言，這個故事就到此為止了。但欣慰的是，微生物學的奇妙旅程仍將繼續。”這是一個沒有終點的探索。相信在下一個20年，厭氧氨氧化的研究還有很多驚喜值得期待。

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